1. Allgemeiner Hinweis
Alle beauftragten Proben werden nach strengen wissenschaftlichen Standards bearbeitet, welche die Nutzung getrennter Laborräume sowie die Durchführung von Analysereplikaten bei allen Untersuchungen beinhalten. Die grundlegende Methode für das bundesweite genetische Monitoring von Wolf und Luchs bilden Mikrosatellitenuntersuchungen (auch STR oder SSR genannt) auf Basis der Kern-DNA, die einen individuell einzigartigen genetischen Fingerabdruck ergeben und Rückschlüsse auf Individuenzahlen, Geschlecht, Verwandtschaften und das Vorkommen von Hybriden erlauben.
Das genetische Wildtiermonitoring ist ein laufender Prozess, bei dem sich jederzeit geringe Änderungen z.B. bei der individuellen Zuordnung oder der Herkunftszuordnung ergeben können. Besonders die Verwandtschaftsanalyse erfordert die Einbeziehung sämtlicher Daten z.T. auch aus anderen (Bundes‑)Ländern. In manchen Fällen reicht die aktuelle Datengrundlage nicht aus, um die Familienstrukturen aufzulösen. Weitere Proben aus den entsprechenden Gebieten können hier eventuell in Zukunft zur Auflösung beitragen. Gerade bei nichtinvasiv gesammelten Proben mit oft suboptimaler Probenqualität wird die individuelle oder verwandtschaftliche Zuordnung stetig neu begutachtet und unter Einbeziehung weiterer Daten neu evaluiert und ggf. aktualisiert.
2. Labormethoden & Datenanalyse
2.1 DNA-Extraktion
Die DNA von sämtlichen nichtinvasiven Proben (Losungen, Urin, Rissabstriche, Haare, Knochen etc.) wird in einem eigens für die Prä-PCR-Behandlung nichtinvasiv gesammelter und forensischer Umweltproben eingerichteten Reinstlabor mittels QiAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen) bzw. QIAamp DNA Investigator Kit und dem QIAcube-Extraktionsroboter (Qiagen) nach Herstellerangaben vorsichtig extrahiert. Zur Kontaminationsvermeidung werden nur DNA-freie und sterile Gerätschaften verwendet und Verbrauchsmaterialien nach jeder Probe gewechselt. Die DNA von Gewebe- und Blutproben wird in einem separaten Labor für Proben mit hohem DNA-Gehalt mittels Blood & Tissue Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben extrahiert, über einen Nanodrop (Thermo Scientific) spektrophotometrisch quantifiziert und für die weiteren Analysen auf ca. 5 ng/μlDNA normalisiert.
2.2 Artbestimmung mittels mitochondrialer DNA (Haplotypisierung)
Über eine Sequenzanalyse der mitochondrialen Kontrollregion wird die initiale Artbestimmung und Haplotypisierung durchgeführt (Pun et al. 2009). Hierfür wird je nach Verdachtsart eine Kombination aus folgenden Markern verwendet:
- Canis-spezifischer Marker zur Erfassung von Wolf (C. lupus), Haushund (C. familiaris) und Goldschakal (C. aureus); Primer WdloopL & WdloopH (Caniglia et al. 2013)
- Säugetier-spezifischer Marker für den allgemeinen Nachweis heimischer Säugetier-Arten; Primer L15995 (Taberlet et al. 1994) & WDloopH (Caniglia et al. 2013) bzw. L15995 (Taberlet et al. 1994) & H16498 (Fumagalli et al., 1996)
- Felidae-spezifischer Marker zur Erfassung von Luchs (Lynx lynx), Wildkatze (Felis silvestris) und Hauskatze (Felis catus); Primer CHR=H16498 (Kocher et al. 1989) & LF4 (Eckert et al. 2009)
- Luchs-spezifischer Marker zur Erfassung von Luchs (Lynx lynx) und der weiteren Unterscheidung der jeweiligen Haplotypen; Primer Lynxfwd4 & Lynxrev5 (Buhrmester 2014)
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wird für jeden Marker zweifach repliziert und die Produkte mit je einem Primer sequenziert. Die Qualitätskontrolle und Datenauswertung erfolgt bioinformatisch auf Basis der erzeugten Sequenz-Chromatogramme unter Verwendung etablierter Software wie z.B. Geneious (Biomatters Ltd), SequenceScanner (Applied Biosystems) und R (R Core Team 2021). Die erhaltenen Sequenzen werden mit der internationalen Datenbank NCBI GenBank sowie mit intern kuratierten Datenbanken abgeglichen. Die Nomenklatur der Haplotypen richtet sich beim Wolf nach Pilot et al. (2010) und Montana et al. (2017), beim Luchs nach Hellborg et al. (2002) und beim Braunbär nach Frosch et al. (2014).
2.3 Mikrosatellitenanalyse der Kern-DNA (Genotypisierung, individueller genetischer Fingerabdruck)
Über eine Mikrosatellitenanalyse der Kern-DNA werden individuelle genetische Profile (Genotypen) von Wolf, Luchs, Goldschakal, Braunbär und Haushund erstellt und mit den Genotyp-Datenbanken am Zentrum für Wildtiergenetik abgeglichen. Bei der Analyse auf Wolf & Goldschakal können ferner einzelne genetische Signale (Allele) vom Fuchs (Vulpes vulpes) nachgewiesen werden. Verwendete Marker:
Wolf, Haushund, Goldschakal: 13 autosomale Marker sowie zwei Marker zur Geschlechtsbestimmung: CPH5 (Fredholm & Winter 1995); FH2001, FH2010, FH2017, FH2054, FH2087, FH2088, FH2097, FH2137, FH2140 and FH2161 (Francisco et al. 1996); vWF (Shibuya et al. 1994); PEZ17 (Neff et al. 1999); DBX6 and DBY7 (Seddon et al. 2005)
Luchs: 23 autosomale Marker sowie zwei Marker zur Geschlechtsbestimmung: LCA110 (Carmichael 2000); F115, FCA005, FCA006, FCA008, FCA026, FCA031, FCA069, FCA082, FCA096, FCA126, FCA149, FCA201, FCA293, FCA424, FCA567, FCA576, FCA650 (Menotti-Raymond et al. 1999); FCA718, FCA723, FCA1018 (Menotti-Raymond et al. 2003); FCA742 (Menotti-Raymond et al. 2005); HDZ700 (Williamson et al. 2002); F-Zf (Pilgrim et al. 2005), SRY (Ciani et al. 2008)
Braunbär: 13 autosomale Marker sowie Geschlechtsbestimmung nach Bidon et al. (2013): Msut2 (Kitahara et al. 2000); G10C, G10P, G10D, G10L (Paetkau et al. 1995); G10H, G10J, G10U (Paetkau and Strobeck 1994); UarMU26, G1A (Taberlet et al. 1997); Mu10, Mu23, Mu5, (Bellemain and Taberlet 2004)
Die Mikrosatellitenanalyse wird bei allen Canis- bzw. Bären-Proben vierfach und bei allen Luchs-Proben dreifach repliziert (Navidi et al. 1992; Taberlet et al. 1999). Die Qualitätskontrolle und Genotypisierung erfolgt auf Basis der erzeugten Elektropherogramme unter Verwendung der Software GeneMarker (Softgenetics). Dabei erhaltene Genotypen werden manuell bzw. mittels eigens dafür entwickelter Software (integriert in elektronischen Beauftragungssystem von Senckenberg (www.wildtiergenetik.de) bzw. R-basiert (R Core Team 2021)) mit den Genotypen bereits bekannter Individuen abgeglichen. Erstmalig nachgewiesene Individuen werden mittels statistischer Gruppierung (Software STRUCTURE, Pritchard et al. 2000) zusammen mit Referenzproben von Haushunden, Goldschakalen sowie Wölfen bzw. Luchsen unterschiedlicher Herkünfte und Unterarten abgeglichen. Dies dient der Bestätigung der Artbestimmung sowie als Grundlage für weitere Verwandtschaftsanalysen. Diese erfolgt computergestützt auch unter Einbeziehung nicht-genetischer Daten aus dem bundesweiten und internationalen Monitoring (Sammeldaten, Altersangaben von Totfunden, Urin/Losung als Markierung, Wanderbewegungen etc.) und im ständigen Austausch mit den Monitoringbeauftragten der Länder. Mit der hier beschriebenen Methode können weiterhin Hybriden der ersten Generation von Wolf und Hund nachgewiesen werden. Rückkreuzungshybriden und weiter zurückliegende Hybridisierungsereignisse können allerdings nur über SNP basierte Analysemethoden zuverlässig nachgewiesen werden (siehe 2.4).
2.4 SNP-Analyse (single nucleotide polymorphism, Einzelpunktmutationen)
Beim Wolf werden im Rahmen der Begleitforschung und in besonderen Verdachtsfällen weiterführende SNP-basierte Analysen zur Hybriddetektion nach Harmoinen et al. (2021) durchgeführt. Diese Analysen ermöglichen die präzise Unterscheidung von Wolf, Haushund und ihren Hybriden mindestens bis in die 3. Hybridgeneration (= 2. Rückkreuzungsgeneration zum Wolf). Für eine sichere Identifizierung der Unterarten beim Luchs steht im Rahmen der Begleitforschung ein 96 SNP-Panel zur Absicherung der Mikrosatelliten-Daten zur Verfügung (Mueller et al. 2022). Zur Auswertung der Daten werden verschieden Methoden der statistischen Gruppierung (Software STRUCTURE, Pritchard et al. 2000; Software NewHybrids, Anderson et al. 2002) sowie intern konzipierte Software herangezogen.
3. Internationale Kooperationen
Um ein fundiertes genetisches Monitoring über Landesgrenzen hinweg zu stehen wir in regelmäßigem Austausch mit internationalen Partnern. Bei Wolf und Goldschakal erfolgt ein enger Austausch basierend auf harmonisierten Methoden über das CEwolf Konsortium (weitere Informationen unter www.senckenberg.de). Beim Luchs findet der Austausch insbesondere über KORA (Muri bei Bern, Schweiz) und dem Institute of Vertebrate Biology (Brünn, Tschechien) statt. Darüber hinaus stehen wir für diese und andere Arten mit weiteren internationalen Experten im Bereich der Wildtier- und Naturschutzgenetik in regelmäßigem Kontakt.
Zitierte Literatur
Anderson EC, Thompson EA (2002). A model-based method for identifying species hybrids using multilocus genetic data. Genetics, 160(3), 1217–1229.
Bellemain E, Taberlet P (2004) Improved noninvasive genotyping method: application to brown bear (Ursus arctos) faeces. Molecular Ecology Notes 4, 519–522.
Bidon T, Frosch C, Eiken HG, Kutschera VE, Hagen SB, Aarnes SG, Fain SR, Janke A, Hailer F (2013) A sensitive and specific multiplex PCR approach for sex identification of ursine and tremarctine bears suitable for non-invasive samples. Molecular Ecology Resources. 13, 362–368.
Buhrmester M, (2014) New genetic markers for rapid identification of large predators from livestock kills. Masterarbeit an der Philipps-Universität Marburg.
Caniglia R, Fabbri E, Mastrogiuseppe L, Randi E (2013) Who is who? Identification of livestock predators using forensic genetic approaches. Forensic Science International: Genetics 7, 397–404.
Carmichael LE, Clark W, Strobeck C (2000) Development and characterization of microsatellite loci from lynx (Lynx canadensis) and their use in other fields. Molecular Ecology 9: 2197-2198.
Ciani F, Cocchia N, Rizzo M, Ponzio P, Tortora G, Avallone L, Lorizio R (2008) Sex determining of cat embryo and some feline species. Zygote 16:2, 169-177.
Harmoinen J, von Thaden A, Aspi J, Kvist L, Cocchiararo B, Jarausch A, Gazzola A, Sin T,Lohi H, Hytönen MK, Kojola I, Stronen AV, Caniglia R, Mattucci F, Galaverni M, Godinho R, Ruiz-González A, Randi E, Muñoz-Fuentes V, Nowak C (2021) A fast and reliable SNP-based approach for accurate discrimination of wolves, domestic dogs and their hybrids based on noninvasively collected samples. BMC Genomics 22: 473
Hindrikson M, Remm J, Pilot M, Godinho R, Stronen AV, Baltrūnaité L, Czarnomska SD, Leonard JA, Randi E, Nowak C, Åkesson M, López-Bao JV, Álvares F, Llaneza L, Echegaray J, Vilà C, Ozolins J, Rungis D, Aspi J, Paule L, Skrbinšek T, Saarma U (2017) Wolf population genetics in Europe: a systematic review, meta-analysis and suggestions for conservation and management. Biological Reviews 92, 1601-1629
Eckert I, Suchentrunk F, Markov G, Hartl GB (2010) Genetic diversity and integrity of German wildcat (Felis silvestris) populations as revealed by microsatellites, allozymes, and mitochondrial DNA sequences. Mammalian Biology 75:160–174.
Francisco LV, Langsten AA, Mellersh CS, Neal CL, Ostrander EA, 1996. A class of highly polymorphic tetranucleotide repeats for canine genetic mapping. Mammalian Genome 7, 359-362.
Fredholm M, Winterø AK, 1995. Variation of short tandem repeats within and between species belonging to the Canidae family. Mammalian Genome 6, 11-18.
Frosch C, Dutsov A, Zlatanova D, Valchev K, Reiners TE, Steyer K, Pfenninger M, Nowak C (2014) Noninvasive genetic assessment of brown bear population structure in Bulgarian mountain regions. Mammalian Biology, 79(4), 268-276,
Fumagalli L, Taberlet P, Favre L, Hausser J, 1996. Origin and evolution of homologous repeated sequences in the mitochondrial DNA control region of shrews. Molecular Biology and Evolution 13, 31-46.
Hatlauf J, Böcker F, Wirk L, Collet S, Schley L, Szabo L, Hackländer K, Heltai M (2021). Jackal in hide: detection dogs show first success in the quest for golden jackal (Canis aureus) scats. Mammal Research 66, 227–236.
Hellborg L, Walker CW, Rueness EK, Stacy JE, Kojola I, Valdmann, Vilà C, Zimmermann B, Jakobsen KS, Ellegren H (2002) Differentiation and levels of genetic variation in northern European lynx (Lynx lynx) populations revealed by microsatellites and mitochondrial DNA analysis. Conservation Genetics 3, 97-111.
Jarausch A, Harms V, Kluth G, Reinhardt I, Nowak C (2021) How the west was won: genetic reconstruction of rapid wolf recolonization into Germany’s anthropogenic landscapes. Heredity 127, 92-106.
Gajdárová B, Belotti E, Bufka L, Duľa M, Kleven O, Kutal M, Ozoliņš J, Nowak C, Reiners TE, Tám B, Volfová J, Krojerová-Prokešová J (2021) Long-distance lynx dispersal – a prospect for connecting native and reintroduced lynx populations in Central Europe. Conservation Genetics 22, 799-809.
Gajdárová B, Belotti E, Bufka L, Volfová J …. Krojerová-Prokešová J (2023) Long-term genetic monitoring of a reintroduced Eurasian lynx population does not indicate an ongoing loss of genetic diversity. Global Ecology and Conservation 42, e02399.
Gugolz D, Bernasconi MV, Breitenmoser-Würsten C, Wandeler P (2008) Historical DNA reveals the phylogenetic position of the extinct Alpine lynx. Journal of Zoology 275: 201-208.
Kitahara E, Isagi Y, Ishibashi Y, Saitoh T (2000) Polymorphic microsatellite DNA markers in the Asiatic black bear Ursus thibetanus. Molecular Ecology 9, 1661–1662.
Kocher TD, Thomas WK, Meyer A, Edwards SV, Pääbo S, Villablanca FX, Wilson AC (1989) Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proceedings of the National Academy of Sciences 86:6196–6200
Lucena-Perez, M, Marmesat, E, Kleinman-Ruiz, D, Martinez-Cruz, B, Węcek, K, Saveljev, AP, Seryodkin, IV, Okhlopkov, I, Dvornikov, MG, Ozolins, J, Galsandorj, N, Paunovic, M, Ratkiewicz, M, Schmidt, K and Godoy, JA (2020) Genomic patterns in the widespread Eurasian lynx shaped by Late Quaternary climatic fluctuations and anthropogenic impacts. Molecular Ecology 29, 812-828.
Lucena-Perez M, Kleinman-Ruiz D, Marmesat E, Saveljev AP, Schmidt K, Godoy JA (2021) Bottleneck-associated changes in the genomic landscape of genetic diversity in wild lynx populations. Evolutionary Applications 21, 2664-79.
Menotti-Raymond M, David VA, Agarvala R, Schäffer AA, Stephens R, O´Brien SJ, Murphy WJ (2003) Radiation hybrid mapping of 304 novel microsatellites in the domestic Cat genome. Genomics 57: 9-23.
Menotti-Raymond M, David VA, Lyons LA, Schäffer AA, Tomlin JF, Hutton MK, O´Brien SJ (1999) A Genetic Linkage Map of Microsatellites in the Domestic Cat (Felis Catus). Cytogenetic and Genome Research 102: 272-276.
Menotti-Raymond MA, David VA, Wachter LL, Butler JM, O’Brien SJ (2005) An STR forensic typing system for genetic individualization of domestic cat (Felis catus) samples. Journal of Forensic Sciences 50:5, 1061–1070
Montana L, Caniglia R, Galaverni M, Fabbri E, Ahmed A, et al. (2017) Combining phylogenetic and demographic inferences to assess the origin of the genetic diversity in an isolated wolf population. PLOS ONE 12(5): e0176560.
Mueller SA, Prost S, Anders O, Breitenmoser-Würsten C, Kleven O, Klinga P, Konec M, Kopatz A, Krojerová-Prokešová J, Middelhoff L, Obexer-Ruff G, Reiners TE, Schmidt K, Sindičič M, Skrbinšek T, Tám B, Saveljev AP, Galsandorj N, Nowak C (2022) Genome-wide diversity loss in reintroduced Eurasian lynx populations urges immediate conservation management. Biological Conservation 266, 109442
Navidi W, Arnheim N, Waterman MS (1992) A multiple‐tubes approach for accurate genotyping of very small DNA samples by using PCR: statistical considerations. American Journal of Human Genetics 50, 347-359.
Neff MW, Broman KW, Mellersh CS, Ray K, Acland GM, Aguirre GD, Ziegle JS, Ostrander EA, Rine J, 1999. A second-generation genetic linkage map of the domestic dog, Canis familiaris. Genetics 151 (2), 803-820.
Paetkau D, Calvert W, Stirling I, Strobeck C (1995) Microsatellite analysis of population structure in Canadian polar bears. Molecular Ecology 4, 347–354.
Paetkau D, Strobeck C (1994) Microsatellite analysis of genetic variation in blackbear populations. Molecular Ecology 3, 489–495.
Pilgrim KL, McKelvey KS, Riddle AE, Schwartz MK (2005) Felid sex identification based on noninvasive samples. Molecular Ecology Notes 5: 60-61.
Pilot M, Branicki W, Jedrzejewski W, Goszczynski J, Jedrzejewska B, Dykyy I, Shkvyrya M, Tsingarska E (2010) Phylogeographic history of grey wolves in Europe. BMC Evolutionary Biology 10.104
Pritchard JK, Stephens M and Donelly P (2000) Inference of Population Structure Using Multilocus Genotype Data. Genetics 155 (2), 945-959
Pun KM, Albrecht C, Castella V, Fumagalli L (2009) Species identification in mammals from mixed biological samples based on mitochondrial DNA control region length polymorphism. Electrophoresis 30, 1008-1014.
Szewczyk M, Nowak C, Hulva P, Mergeay J, Stronen, AV, Černá Bolfíková B, Czarnomska SD, Diserens T A, Fenchuk V, Figura M, de Groot A, Haidt A, Hansen MM, Jansman H, Kluth G, Kwiatkowska I, Lubińska K, Michaux JR, Niedźwiecka N, Nowak S, Olsen K, Reinhardt I, Romański M, Schley L, Smith S, Špinkytė-Bačkaitienė R, Stachyra P, Stępniak KM, Sunde P, Thomsen PF, Zwijacz-Kozica T, Mysłajek RW (2021) Genetic support for the current discrete conservation unit of the Central European wolf population. Wildlife Biology, wlb.00809.
Szewczyk M, Nowak S, Niedźwiecka N, Hulva P, Špinkytė-Bačkaitienė R, Demjanovičová K, Černá Bolfíková B, Antal V, Fenchuk V, Figura M, Tomczak P, Przemysław Stachyra, Stępniak K M, Zwijacz-Kozica T & Mysłajek R W (2019): Dynamic range expansion leads to establishment of a new, genetically distinct wolf population in Central Europe. Scientific Reports 9, 1-16.
Seddon JM, 2005. Canid-specific primers for molecular sexing using tissue or non-invasive samples. Conservation Genetics 6, 147-149.
Shibuya H, Collins BK, Huang TH-M, Johnson and GS, 1994. A polymorphic (AGGAAT)n tandem repeat in an intron of the canine von Willebrand factor gene. Animal Genetics 25, 122.
R Core Team (2021) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria
Sunde P, Collet S, Nowak C, Thomsen PF, Hansen MM, Schulz B, Matzen J, Michler FU, Vedel-Smith C, Olsen K (2021) Where have all the young wolves gone? traffic and cryptic mortality create a wolf population sink in Denmark and northernmost Germany. Conservation Letters, e12812.
Taberlet P, Bouvet J (1994) Mitochondrial DNA polymorphism, phylogeography, and conservation genetics of the brown bear Ursus arctos in Europe. Proceedings of The Royal Society B – Biological Sciences 255, 195–200.
Taberlet P, Camarra JJ, Griffin S, Uhres E, Hanotte O, Wait, LP, Dubois-Paganon C, Burke T, Bouvet J, (1997) Noninvasive genetic tracking of the endangered Pyrenean brown bear population. Molecular Ecology 6, 869–876.
Taberlet P, Luikart G, Waits LP (1999) Noninvasive genetic sampling: look before you leap. Trends in Ecology and Evolution 14, 323-327.
Williamson JE, Huebinger RM, Sommer JA, Louis EE, Barber RC (2002) Development and cross-species amplification of 18 microsatellite markers in the Sumatran tiger (Panthera tigris sumatrae). Molecular Ecology Notes 2:2, 110–112.